Single-cell analysis of psoriasis resolution demonstrates an inflammatory fibroblast state targeted by IL-23 blockade

https://www.nature.com/articles/s41467-024-44994-w

2024 year, nature communications, 1 citation (impact factor 16.6)

Abstract
일반적으로 건선 치료는 IL-23/IL-17을 표적으로하지만, 여전히 작용 메커니즘은 알려져 있지 않다.
따라서 scRNA-seq을 이용한 longitudinal analysis 를 통해 치료 3일차 및 14일차 피부를 프로파일링했다.
이를 통해 fibroblast and myeloid polpuation에서 IL-23 차단이 현저한 효과를 나타냈으며
fibroblasts WNT5A+/IL24+ 신호가 염증 유전자를 상향 조절함을 확인함.
inflammatory fibrolbast states가 psoriasis skin의 주요 특징임을 확인함.

 

Introduction

 

여기에서는 IL-23 차단 효과의 기본이 되는 초기 사건을 밝혀내어 피부 항상성을 조절하는 주요 과정을 이해하려고 합니다. 

우리는 IL-23 억제제인 리산키주맙을 투여받은 개인을 대상으로 건선 피부의 종단적 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 수행했습니다. 이를 통해 건선 병변에서 풍부하게 나타나는 전 염증성 WNT5A+/IL24+ 섬유아세포 상태를 식별하여 초기 질병 해결에 대한 고해상도 아틀라스를 생성하였습니다. 이 집단은 TNF 및 IL-17 신호 전달의 현저한 상향 조절을 나타내며, 치료 개시 후 3일부터 상당히 감소하기 시작합니다. 중요한 것은, WNT5A+/IL24+ 섬유아세포의 조기 감소가 다른 전신 및 국소 치료법을 받는 환자에서도 관찰된다는 점입니다. 이는 이 세포 상태의 정상화가 건선 염증 해결에 중요하다는 것을 시사합니다.

### 1. 종단적 분석과 scRNA-seq
피부는 외부 공격으로부터 보호하는 동시에 미생물 제제에 대한 선천적 및 적응적 반응을 조율하는 전형적인 장벽 조직입니다. 그러나 피부 병변의 프로파일링은 말기 질병의 순간적인 모습만을 제공할 뿐이며, 병리학의 시작과 해소로 이어지는 사건의 순서에 대한 통찰력은 제한적입니다. 이러한 맥락에서, 질병 해결에 대한 종단적 분석은 약물 작용의 초기 메커니즘을 밝히고 항상성 회복을 촉진하는 근본적인 사건을 식별할 수 있습니다.

### 2. 건선의 중요성
건선은 유럽계 개인의 최대 2%에 영향을 미치는 만성 면역 매개 피부 질환입니다. 이는 다양한 질병, 삶의 질 저하 및 심혈관 사망률 증가와 관련이 있습니다.

### 3. IL-23/17 메커니즘
수지상 세포와 대식세포에서 생성된 IL-23은 T17 세포의 분화를 촉진하여 IL-17의 방출을 유도합니다. TNF와 시너지 효과를 발휘하는 이 사이토카인은 케라티노사이트를 증식시키고 T17 세포를 염증 부위로 더 유인하는 케모카인을 생성하도록 합니다. 이어지는 피드백 루프는 건선의 두 가지 특징인 만성 염증(chroic inflammation)과 표피 증식(epidermal hyperplasia)을 유지합니다.

The Role of Leptin in the Association between Obesity and Psoriasis

 

Methods

scRNA-seq data processing

1. Cell Ranger - scRNA data load and filter <300 or >4000 and greater than 20% of genes of mitochondrial origin 
2. scDBIFinder - doublets
3. Seurat (v4.1.0) - to avoid batch effect, normalizaed and then scaled by regression out

(이해를 바탕으로 작성합니다.) 

Cell clustering and cell type annotation

1. Seruat,  linear dimensinal reduction
2. Seruat, FindNeighbours (K-Nearest Neighbor graph) - to organize the graph in preparation for clustering
   1. 주성분 분석에서 도출된 처음 10개를 주성분을 기반으로
   2. 세포간의 유사성을 평가
   3. 각 세포의 이웃들과의 공유되는 유사성 (Jaccard similarity) 을 바탕으로 에지의 가중치를 조정
   4. 클러스터링 작업 전, 세포들의 관계를 그래프 구조(KNN)로 정리
3. Seruat,  FindClusters(unsupervised cell clustering)  - to clustering
   : 앞선 그래프 구조를 사용하여 클러스터링(Louvain 알고리즘)
4. Seruat,  FindAllMarkers - to find DEGs (fold change >1.5; Bonferroni adjusted p value < 0.05)
   : 주석 전 단계로, 각 클러스터를 식별하기 위해  해당 클러스트를 특징짓는 marker는 찾는 과정
5. 이러한 클러스터별 유전자를 해당 세포 유형에 대해 공개된 시그니처 유전자와 상호 참조하여 주석달았다.

Differential expression analysis

1. Seurat, FindMarkers  - to find DEGs,
   1. 0일째와 3일째 또는 0일째와 14일째 사이의 DEG 찾기 위함
   2. 두 샘플 그룹에서 5% 미만의 세포에서 검출된 유전자는 제거
   3. 환자 ID 기반으로 negative binomial regression
      1. 발현 데이터의 카운트가 음이항 분포를 따른다고 가정
      2. 이 분포는 발현 데이터에서 관찰되는 과분산을 모델링할 수 있게된다.
      3. 과분산은 관측된 변동성이 단순 포아송 분포로는 설명이 불가능할 정도로 큰 경우를 말한다.
      4. '환자 ID'와 같은 잠재 변수를 모델에 포함함으로써, 각 환자의 고유한 특성이 결과의 분석에 미치는 영향을 정확히 고려

Identification of enrichned pathways, upstream regulators and gene regulatory networks

1. Qiagen -  to identify canonical pathways and upstream regulators that were enriched (FDR < 0.05) DEGs
2. SCENIC - to identify gene regulatory network
   1. • 레귤론(Regulons): 전사 인자와 직접적으로 조절하는 타겟 유전자들로 구성된 모듈입니다. SCENIC은 GRNBoost를 사용하여 초기에 공표식 모듈을 예측한 후, RcisTarget을 통해 전사 인자가 직접 조절하는 타겟 유전자들을 식별하여 레귤론을 세밀하게 정의합니다.
      • AUCell: 레귤론을 정의한 후, SCENIC은 AUCell을 사용하여 각 세포에 대한 레귤론 활성 점수를 계산합니다. 이 점수는 레귤론의 타겟 유전자들이 임의의 유전자 집합보다 활발하게 전사되는지를 평가하여 각 레귤론의 활성을 정량화합니다.
   2. SCENIC 분석 결과:
      • WNT5A+/IL24+ 섬유아세포에서 FOXQ1, TBX3, PRDM1 레귤론이 풍부하게 관찰되었습니다. 이는 이러한 전사 인자들이 해당 세포들의 유전자 발현 풍경을 조절하는 주요 역할을 한다는 것을 제시합니다.

Cell-cell interaction inference

다양한 세포 유형과 조건이 포함된 연구에서 세포 간 상호작용, 특히 수용체-리간드 상호작용을 분석

1. CellChat - 알려진 수용체-리간드 쌍을 기반으로 세포 간의 잠재적 신호 상호작용을 추론하고 분석
2. Subcluster Analysis - 각질 세포, 섬유아세포, T 세포, 골수 세포와 같은 이질적인 집단 내 세포 상호작용의 복잡성을 하위 클러스터로 분류
3. NicheNet - 특히 IL-24와 그 수용체와 관련된 특정 신호 상호 작용 확인
   표적 세포 행동에 영향을 미칠 수 있는 잠재적 신호 경로를 식별에 유용

Cell culture

Pseudotime anlaysis

1. Seurat(SeuratWrappers, cell_data_set )에서 생성된 섬유아세포 데이터를 Monocle 3을 사용하여 분석한 과정
2. Monocle(cluster_cells) -
   1. 클러스터링, Leiden community detection
   2. 세포궤적학습 , learn_graph : 세포의 발달 경로를 추적하여 세포가 시간에 따라 어떻게 변화하는지 이해
   3. 세포 순서 지정, order_cells 함수를 사용하여 세포의 순서를 결정 : order_cells 함수를 사용하여 세포의 순서를 결정

Re-analysis of publicly anvailable datasets

...

RNA fluorescence in stiu hybridization

Statistical analysis

GraphPad Prism(Windows용 버전 9.3.0)에서 구현

1. scRNA-seq 및 RNA in situ 하이브리디제이션 결과 분석: 네 가지 샘플 그룹(비병변, 병변 0일, 병변 3일, 병변 14일) 간 세포 유형의 상대적 풍부도를 비교합니다. 이를 위해 반복 측정 분산 분석(Repeated Measures ANOVA)을 사용하고, Dunnett's post-test를 수행하여 그룹 간의 통계적 차이를 검정합니다.
2. 디컨볼루션을 통해 도출된 세포 분획 분석: WNT5A+/IL24+ 섬유아세포의 상대적 풍부도를 치료 그룹 간에 비교합니다. 이 분석에도 반복 측정 분산 분석을 사용하며, 필요에 따라 Dunnett's post-test 또는 paired t-test를 적용합니다.
3. 실시간 PCR을 통해 얻은 데이터의 유의성을 평가하고, 다양한 처리 그룹 간의 차이를 분석합니다. Kruskal-Wallis test 또는 Friedman test 사용: 데이터의 분포가 정규 분포를 따르지 않을 경우 비모수 통계 검정을 사용합니다. 이후 Dunn’s multiple comparison test를 수행하여 그룹 간의 상세한 비교를 진행합니다

[SPSS 22] 반복측정 분산분석(Repeated Measures ANOVA)

 

Repeated Measures ANOVA - Understanding a Repeated Measures ANOVA | Laerd Statistics

 

 

 

Results

 

5명이 모두 clear하게 효과가 있는 결과만 보임 -> 실제는 차이가 많을 것이다. 이 약물이 잘 듣는 환자들만 뽑아낸 것일 것.
매커니즘을 밝히기 위함이라서 이런 환자를 필터링한 것일까?

resolution = 0.4

전체 클러스터링 수행 후에 -> KC만 뽑아서 다시 sub cluatering 수행

-> sub clustering 결과가 더 잘 나오게 되었다.

20 sample에 대해서 clear signal

sup에 sample 별 색칠된 cluser 그림을 확인하면 골고루 섞인 모습을 확인 가능하다(bias가 잘 되었다)

 

clustering를 구성하는 점들이 여러 샘플별(condtion 0, 3, 14 days..)로 올 수 있는데 -> 그냥 그림만 가져오고 실제 DEG는 Day 0 vs 3 / Day 0 vs 14 이다.

이미 annotation을 한 cell 을 그대로 이용 -> cell type간 DEG를 구한 것

-> Day3 : IL23이 특히 FB, MYEL 와 활발히  반응, Day14 :  KC 

왜 DEG 갯수 -> cell의 activation을 해석하기위해 사용하는 것이 특이적

FC >1.5 로 후하게 점수를 줘도, DEG가 그렇게 많이 나온 것은 아님(day3 ranger 0~30)

 

시간별 상호작용 갯수 비교 -> conditino 별로도 응용해볼 수 있겠다.

 

Fig. 4: Effects of IL-23 inhibition on vascular endothelial cells and pericytes.

을 통해서 IL-23 불을 끄기 위해 몰려드는 모습

명료한 cluster

WNT5A와 시그널하는 COMP와도 가까이 위치하는 것을 확인 

WNT5A가 0 -> 3-> 14 비율이 줄어드는 것까지 확인

 

 

Figure 6F. Diagram showing the early effects of therapeutic IL-23 inhibition.