Engineering E. coli strains using antibiotic-resistance-gene-free plasmids
https://www.cell.com/cell-reports-methods/fulltext/S2667-2375(23)00348-X?hss_channel=tw-18477428
2023, Cell Reports Methods, 27 citation
생공세미나 수업으로 다른 랩실 학생분께서 소개한 논문
MOTIVATION 플라스미드는 유전공학에서 필수적인 도구이다. 그러나 플라스미드를 세포 집단 내에서 유지하기 위해 항생제 내성 유전자를 사용하는 현재의 방식은, 특히 통제되지 않은 환경에서 항생제 내성 확산의 위험이 있다. 이에 우리는 항생제 내성 유전자가 전혀 없는 플라스미드(ARGFPs)를 제안한다. 이 플라스미드는 클로닝에 사용할 수 있으며, 장기간 계대배양(subculturing)되거나 생쥐 장내(murine gut)으로부터 얻은 공학적으로 조작된 E. coli 균주에서도 안정적으로 유지될 수 있다.
SUMMARY 우리는 항생제 내성 유전자(ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE)에 자유로운 플라스미드(ARGFP) 기반의 클로닝을 위한 범용적 파이프라인을 구축했다. 이는 영양요구성(auxotrophic) 유전자와 필수(essential) 유전자를 동시에 사용 선택 전략을 사용한다. 우리는 조작된 E. coli DH10B 클로닝 균주에서 영양요구성 기반 선택 플라스미드를 만들었다. 이후 E. coli Nissle 1917과 실험용 표준 균주인 E. coli MG1655에서 영양요구성 + 필수유전자 기반 선택을 모두 활용하여(1) 재조합 균주의 선택과 (2) 플라스미드의 장기 유지를 수행했다. 우리의 접근법은 항생제 내성 유전자를 사용하는 기존 클로닝 방식과 동일한 수준의 효율을 보였다. 또한, double-knockout된 Nissle과 MG1655 균주는 원하는 플라스미드로 쉽게 형질전환될 수 있음을 확인하였다. 특히, 엔지니어링된 Nissle 균주는 반복 배양 조건에서도, 그리고 생쥐 장내(mouse gut)에서도 플라스미드를 장기간 안정적으로 유지할 수 있음을 보여주었다. 이는 항생제 내성 유전자 수평전이(HGT)에 의한 확산 위험을 최소화하면서, 넓은 범위의 응용이 가능함을 증명한다.
1. Introduction
플라스미드는 작은 크기·다양한 복제수·정제의 용이성 덕분에 약 70년 동안 유전공학에서 필수적인 도구로 사용되어 왔다. 복잡한 유전회로를 구축하거나 이종 단백질을 과발현하는 데 가장 간단한 방법이기 때문이다. 그러나 플라스미드 유지에는 보통 항생제 내성 유전자(ARG)가 필요하며, 이는 통제된 환경인 실험실에서는 잘 동작하지만
- 대규모 배양 시스템에서는 비용이 너무 크고,
- 비통제 환경(환경정화, 치료용 미생물 등)에서는 사용 자체가 부적절하다.
또한, 실험실에서조차 항생제나 ARG를 가진 생물체의 폐기물이 항생제 내성 확산의 위험을 초래한다. 낮은 농도의 항생제에 장기간 노출되면 자연적으로 내성이 생길 수 있고, ARG를 가진 실험실 균주는 죽어 있어도 수평적 유전자 전달(HGT)을 통해 사람·농업 병원균으로 퍼질 수 있다. 또한 플라스미드는 비멸균 환경(흙·담수·해수)에서 최대 8일간 살아남아 토착 미생물을 형질전환시킬 수 있다. 특정 항생제는 해당 항생제의 저항성이 플라스미드에 없어도 HGT를 촉진시키기도 한다. 따라서 항생제 없이 플라스미드를 선택·유지하는 대안적 시스템이 절실하다. 이 대안은 크게 두 가지 방향이 있다.
- 유전체 통합(genomic integration)
- 삽입된 유전자는 세포 분열 시 안정적으로 유지됨
- 하지만 발현량 조정, 여러 번의 통합 작업 등이 필요하고
반복적 디자인-빌드-테스트 과정에서 매우 비효율적
- 비항생제 기반 플라스미드 선택 시스템
- 필수 유전자, 항독소 유전자, 영양요구성 유전자 등으로 선택
- 또는 균주 고유의 플라스미드를 개조해 사용
- 그러나 문제점 존재:
• 영양요구성 기반은 환경에서 cross-feeding으로 선택압이 쉽게 사라짐
• amber 억제 tRNA 필요 등 복잡성
• 필수유전자 기반은 매번 knockout + 플라스미드 제공이 필요
• 많은 플라스미드가 여전히 원래 클로닝 과정에서 생성된 ARG 카세트를 포함 → 환경에서 HGT로 내성 확산 위험
• ARG를 제거하려면 추가적인 제거 단계 필요
이 연구는 위 한계들을 해결하기 위해 다음을 도입한다:
- 영양요구성 유전자 + 필수유전자를 플라스미드에 통합한 dual-selection 기반 ARG-free 시스템을 설계
- DH10B auxotroph에서 항생제 없이 플라스미드 조립 가능
- 실사용 균주로 E. coli Nissle 1917 (EcN) 및 E. coli MG1655을 사용
(두 균주 모두 auxotroph + essential gene 이중 knockout)
이 시스템은
- 기존 항생제 기반 방법과 동등한 변형 효율적
- double-knockout 균주는 플라스미드 도입도 쉬움
- 계대배양 1달 동안 안정적으로 플라스미드 유지
- 생쥐 장내에서도 최소 12일 안정적으로 유지
- 항생제 없이도 장기 플라스미드 유지가 가능함
4. Materials & Methods
목적:
- 항생제 내성 유전자를 전혀 사용하지 않고(plasmid construction / maintenance 모두)
auxotrophic gene + essential gene을 이용한
일관된 ARG-free 플라스미드( pA ) 구축 전략. - DH10B auxotroph에서 플라스미드 조립 →
EcN double-knockout에서 단 한 번의 transformation으로 pA로 교체시키는 전체 workflow 제시.
결과
- DH10B ΔauxG에서 auxotrophic gene을 플라스미드가 제공하도록 하여 항생제 없이 플라스미드 선택 성공
- EcN Δ(auxG, essG)에서 pR-essG recombineering plasmid → pA 플라스미드를 sucrose + 42℃ 처리로 한 번에 교체
5. Evaluation & Findings
실험 목적
- thyA 및 glmS auxotrophic marker가
항생제 기반 선택과 동일한 수준의 플라스미드 선택 효율을 낼 수 있는지 실험적으로 검증. - Gibson assembly된 plasmid도 auxotrophic selection으로 안정적으로 선별 가능한지 확인.
실험 결과
- DH10B ΔthyA / ΔglmS, EcN ΔthyA / ΔglmS 모두에서
auxotrophic selection 효율 ≈ antibiotic selection 효율 - Gibson assembly plasmid는 supercoiling이 없어 효율이 약간 낮지만,
선별된 콜로니는 100% 플라스미드 보유 - → auxotrophic gene만으로 항생제 없이 플라스미드 선택이 충분히 가능함을 입증.
실험 목적
- EcN Δ(auxG, essG)에서 recombineering plasmid(pR-essG)를
단일 transformation으로 pA 플라스미드로 교체할 수 있는지 검증. - 필수유전자 기반 선택(essential gene marker)의 기능성 실증.
실험 결과
- sucrose + 42℃ 조건에서 pR-infA → p1, pR-nadE → p2 변환 성공
- 일부 조합(p2)은 이론적 최대치에 가까운 형질전환 효율 달성
- 재플레이팅 결과:
거의 모든 colony가 pA만 유지, pR-essG는 드물게 잔존하나 실제로는 생장 거의 불가
→ 기능적으로 pR 완전 제거됨 - essential gene + auxotrophic gene dual selection이
단독 essential보다 교체 압력이 훨씬 강력함을 증명.
실험 목적
- 단일 auxotroph knockout(EcN ΔthyA, ΔglmS) vs
double-knockout(EcN Δ(thyA, infA), Δ(glmS, nadE)) 간 플라스미드 장기 유지 능력 비교 - aux compound(Thy, NAcG)를 공급하면 플라스미드가 유실되는지 확인.
실험 결과
- ΔthyA + Thy 조건 → 24일 이후 플라스미드 대량 손실
- Δ(glmS) + NAcG는 손실이 거의 없었으나 실험적 artifact 가능
- 두 double-knockout(EcN Δ(thyA, infA) 및 Δ(glmS, nadE))는
1달간 어떤 조건에서도 손실 없음 - → 플라스미드 유지에는 essential gene 보완이 핵심.
실험 목적
- p1/p2 plasmid에서 항생제 유전자를 완전히 제거하고
GFP 또는 mCherry를 gene-of-interest로 대체해도
동일 workflow로 성공적으로 클로닝·교체·유지 가능한지 검증. - long-term maintenance를 fluorescence 기반 flow cytometry로 평가.
실험 결과
- DH10B auxotroph에서 GFP/mCherry 플라스미드 조립 및 선택 성공
- EcN double-knockout에서 pR-essG → pA(GFP/mCherry) 교체 성공
(Amp plate에서는 자라지 않음 → pR 완전 제거됨) - 장기 배양 결과:
auxotrophic knockout 단독은 보조 물질(Thy/NAcG) 존재 시 플라스미드 유실
double-knockout은 ±aux 조건 모두에서 강력한 장기 유지 - → 완전 ARG-free 시스템이 항생제 플라스미드와 동일 또는 우수한 안정성 보유.
실험 목적
- ARG-free 시스템이 EcN뿐만 아니라 E. coli MG1655(wild-type lab strain)에도 적용 가능한지 검증.
- 생쥐 장내에서도 ARG-free plasmid가
항생제 내성 기반 플라스미드보다 안정적으로 유지되는지 평가.
실험 결과
1) MG1655 확장성
- MG1655 Δ(thyA, infA) 및 Δ(glmS, nadE)에서도
p1/p2 모든 variant 형질전환 성공 - high-copy + fluorescent 유전자는 부담이 높아 성장 저해
→ plasmid copy number 최적화 필요
2) 생쥐 장내(mouse gut) 실험
- WT + p1-M-gfp-specR: 12일간 플라스미드 지속적으로 손실됨
- Δ(thyA, infA) + p1-M-gfp 또는 gfp-specR:
지속적으로 높은 플라스미드 유지율 - → 항생제 기반 플라스미드는 in vivo에서 선택압이 없어 유지되기 어려우나
ARG-free essential gene 기반 시스템은 장내에서도 매우 안정적
