A Novel Balanced-Lethal Host-Vector System Based on glmS
https://academic.oup.com/gigascience/article/doi/10.1093/gigascience/giad057/7246583
2013, PLOS ONE, 33citation
생공세미나 수업 3번째 논문이다. 항체공학 실험실 선생님께서 발표하셨다.
1. Problem
- 항암 치료에서 E. coli와 S. typhimurium과 같은 세균을 이용해 종양 부위에 선택적으로 축적시키고, 이를 치료 단백질 전달 벡터로 활용하는 전략이 각광받고 있음.
- 그러나 기존 시스템에서는 치료유전자를 담은 플라스미드가 세균 생존에 필수적이지 않기 때문에 in vivo 환경에서 플라스미드 손실이 빈번하게 발생함.
- 염색체 → 생존에 꼭 필요한 유전자들 (대사, 번식 등)
- 플라스미드 → 생존에는 직접 필요하지 않지만, 특정 기능(항생제 저항, 단백질 발현 등)을 추가로 부여
- 세균은 생존에 불필요한 플라스미드를 점점 잃어버리는 방향으로 진화함으로써, 세대가 지날수록 플라스미드 없는 세균이 우세해짐.
- 항생제 저항성 마커를 이용한 선택압 유지 방식은 동물 모델에서 적용이 어렵다는 한계가 있음.
- 선택압(selection pressure): 여기서 선택압은 플라스미드가 생존에 필요한 강제성이 있는 환경을 의미. 즉 항생제(ampicillin)이 들어있는 배지에 세균을 키워서 플라스미드에 항생제 저항성 유전자가 존재하는 세균만 살아남도록 함.
- 하지만 동물 혈중에 항생즐 지속적으로 유지시키기 어렵다. 또한 독성 부작용 발생 가능할 뿐만아니라 임상 적용도 사실상 불가능하다.
2. Related Work
*고전 유전학의 balanced-lethal 개념에서 유래한 방법으로
미생물공학에서는 세균이 생존에 필수적인 유전자를 게놈에서 삭제하고 플라스미드에 넣어
플라스미드를 잃으면 세균이 죽도록 설계한 시스템을 일컫음.
- 기존의 대표적 balanced-lethal 시스템으로는 asd 유전자 기반 시스템이 있음.
- 새로운 선택지 제안:
glmS 유전자는 세균의 펩티도글리칸 합성에 필수적인 GlcN-6-P 생합성에 관여하므로 balanced-lethal 시스템에 적용 가능성이 있음.
3. Idea
- glmS 결손 변이주(GlmS⁻)는 GlcN/GlcNAc 공급이 없으면 생존 불가 → in vivo 환경에서는 충분한 GlcNAc가 없어 자멸.
- glmS를 발현하는 플라스미드(GlmS⁺ plasmid)를 보완제로 도입하면 세균이 생존하기 위해 반드시 플라스미드를 유지해야 함.
- 이를 이용하여 항생제 선택압 없이도 종양 부위에서 플라스미드의 안정적 유지 및 치료유전자 지속 발현이 가능하다는 것이 핵심 아이디어.
| 구분 | asd system | glmS system( 제안된 방법) |
| 필수 유전자 | asd (aspartate semialdehyde dehydrogenase) | glmS (glucosamine-6-phosphate synthase) |
| 치명적 결핍 성분 | DAP (cell wall precursor) | GlcN/GlcNAc (cell wall precursor) |
| 특징 | 오래된 대표적 balanced-lethal system | 후속 개발된 system, bioluminescence 등과 결합 용이 |
| 논문 예 | Galán et al. 1990 | Kim et al. 2013 (PLoS ONE) |
4. Materials & Methods
- Strains: E. coli (MG1655 기반) 및 S. typhimurium (14028s 기반), glmS 결손 변이주 제작.
- Plasmids: glmS, lux operon (bioluminescence reporter), GFP 발현 플라스미드 제작 및 조합.
- In vitro: GlcNAc 존재 유무에 따른 생존, lysis assay, Western blot, 플라스미드 유지율 측정.
- In vivo:
- CT26, 4T-1, ASPC-1 종양 이식 마우스 모델 구축.
- GlmS⁻ 균주와 GlmS⁺ 플라스미드 보완 균주 주입 후 IVIS imaging으로 생체 내 발현 및 CFU 측정.
- 세포 침입/증식 실험 (HeLa, 대식세포).
5. Evaluation & Findings
- GlmS⁻ 균주는 GlcNAc이 없는 조건에서 급격히 사멸 및 용해됨.
- glmS 플라스미드를 도입한 균주는 항생제 없이도 안정적으로 플라스미드를 유지.
- 종양 이식 마우스에서 bioluminescence intensity는 wild-type보다 10~100배 이상 강함, 이는 플라스미드 손실이 거의 없음을 의미.
- S. typhimurium에서도 동일한 원리가 적용되어, **다양한 종양 모델(CT26, 4T-1, ASPC-1)**에서 7일 후에도 거의 모든 세균이 플라스미드를 유지.
- glmS 시스템은 세균 내적 선택압을 유도하여 항생제 없이도 안정적 발현을 가능하게 함.
6. Take away
- glmS 기반 balanced-lethal 시스템은 기존 asd 시스템의 한계를 보완하며, in vivo 플라스미드 안정성을 획기적으로 향상시킴.
- 항생제 선택압 없이도 치료유전자를 안정적으로 유지할 수 있어 항암 세균 치료(bacterial cancer therapy)에 매우 유용함.
- lux operon을 통해 생체 내에서 비침습적 정량 모니터링도 가능함 → 치료 효과 평가와 모니터링에 실용적.
- 향후 유전자 치료, 항암 단백질 전달, 이미징 플랫폼 등으로 확장 가능성이 큼.
기존의 asd system과 비교했을 때, cost effiency나 low toxity등의 더 좋은 점은 없나? 다양한 플랫폼으로의 확장은 중요하지만
독성이 충분히 검토되었는지? 물어볼것