Single-cell transcriptomics applied to emigrating cells from psoriasis elucidate pathogenic versus regulatory immune cell subsets (수정중) (요약), scRNA-seq 분석 사례와 Wilcoxon rank sum test
2021 year, journal of allergy and clinical immunology, 33 citation (14.290 IF)
https://www.jacionline.org/article/S0091-6749(21)00662-X/fulltext#appsec1
Background
- 이전의 human skin single-cell data에서, 전체 세포중 염증 세포(inflammatory cells)가 차지하는 부분은 굉장히 작아 functional subset을 식별이 어렵다.
Objective
- 앞서 언급한 제한점을 극복하기위해, single-cell transcriptomic을 적용한다.
- 건선이 있는 개인의 피부에서 pathogenic versus regulatory immune cell subsets의 발현 프로필을 밝힌다.
Methods
- 효소 소화나 세포 분리 없이 배지에 인간 건선 피부를 배양하여 emigrating cell 를 얻는다.
- scRNAseq 과 유세포분석기을 사용하여 세포 분석
Results
- 건선 피부와 정상 피부에서 얻은 세포들로부터 unsupervised clustering 한 결과
총 5개의 immune cell subsets & emigrating cell 을 각 다른 피부 층에서 식별했다.
(natural killer cells, T-cell subsets, dendritic cell subsets, melanocytes, and keratinocytes)
Conclusion
- huma skin의 emigrating cell에 single-cell transcriptomic을 적용하는 것은 heterogenous immune cell의 유전자 발현 프로파일을 비교할 수 있도록 한다.
*cell migration : 면역세포를 포함한 여러 세포 유형들의 움직임을 의미하며, 이러한 움직임은 성장 및 생리 활동을 위한 필수적인 과정이다. 논문에서 언급하는 emigrating cell의 경우 피부에서 이동하는 세포를 가리킨다. 일반적으로 염증성 피부 질환에서 염증 반응이 진행될 때, 면역 세포들이 혈관 벽을 통해 피부 조직으로 이동하는 경향이 있다.
* flow cytometry : 유세포분석기, 한번에 한 개의 세포를 흘려보내서 세포 하나씩 분석하는 기술, 형광 표지를 통해 분석합니다.
Introduction
표피결절은 인간의 가장 흔한 염증성 질환이다.
IL-17을 생성하는 17형 T세포 (T17세포)에 의해 매개된다.
CD4+ (TH17) 및 CD8+ (cytotoxic type 17 T세포) 하위 집단을 포함한다.
T17세포의 이질성(heterogeneity)이 있으며, IL-17A, IL-17F (동질이식체) 혹은 IL-17A/F (이종이식체)이 존재한다.
이러한 IL-17 이형은 대상 세포의 IL-17 수용체를 활성화시키는 능력이 서로 다르다.
IL-17A과 IL-17F를 생성하는 T세포에서 병원성 및 규제성 표지자의 발현 상태를 현재로서는 알 수 없습니다.
* IL-17을 생산하는Th17세포는 동물모델과 인간 세포 연구 결과들을 통해 염증 및 자가면역 병인에 직접적인 역할 과 병원체에 대한 숙주 방어 또는 이상 면역반응 유도 등의 역할이 규명되었다.
https://synapse.koreamed.org/upload/synapsedata/pdfdata/0130hmr/hmr-33-17.pdf
건선성 병변의 만성성은 negative regulatory pathways의 결함에 의해 발생한다.
1. regulatory T (Treg) cell 의 기능 감소
2. type 1 Treg (Tr1) cells 수의 감소
3. negative regulatory factors의 낮은 발현(과민성 피부반응 병변에서 강하게 발현되는)
그러나 Treg세포 및 기타 규제성 면역세포의 특성은 인간 피부에서 거의 탐구되지 않았다.
*Psoriasis vulgaris : 건선, 증상
정상 피부에서 일부 골수유래의 수상돌기 세포 (DCs) 하위집단이 존재
- BDCA-3 발현, IL-10 생산, 및 음의 면역 조절자 발현
이들은 비염증적인 상태에서 면역 조절 및/또는 내성에 기여하는 조절 세포로 간주
그러나 건선 병변에서 DCs 하위집단인 CD11c+ DCs와 DC-LAMP 발현되는 성숙 세포의 수가 증가하여, 염증을 일으킨다.
그러나 DC 하위집단에서 염증성 및 규제성 분자의 상대적 발현은 인간 피부에서 탐구되지 않았다.
* CD11c+ DCs와 DC-LAMP 발현과 연관된 성숙한 세포들은 DC (Dendritic Cell) 세포군에 속합니다.
* CD11c는 일반적으로 수상돌기 세포의 표면에 발현되는 마커로, 이를 이용하여 DCs를 식별할 수 있습니다. D
* C-LAMP (Dendritic Cell-Lysosomal Associated Membrane Protein)은 성숙한 DCs에서 발현되는 표면 단백질로, DCs의 성숙 상태를 나타내는 마커로 사용됩니다.
scRNA-seq은 인간 피부의 개별 백혈구 또는 다른 조직 내 세포의 유전자 발현을 특성화하는 강력한 기술이다.
그러나 피부 세포 외에도 섬유아세포 및 각피세포 (KCs)와 같은 다른 피부 세포들이 전체적인 세포 혼합물을 지배하기 때문에
인간 피부에서 백혈구 하위집단을 깊이 연구하는 것은 어렵다.
* 즉, 인간 피부에서 백혈구 하위집단은 전체 세포 중에서 굉장히 작은 부분을 차지하기 때문에 깊이 있는 연구가 어렵다는 뜻이다.
본 연구에서는 세포 분류나 활성화 없이 피부 생검 시료로부터 이동하는 세포를 사용하여 건선과 정상 피부에서 scRNA-seq를 수행
이를 통해 다양한 T17세포 하위집단, Treg세포, 성숙 및 반성숙 DC 하위집단, 그리고 KCs의 다양한 층에서 새로운 및 독특한 유전자 발현 패턴을 발견하였으며, 이는 질환과 관련이 있으며 건선에서 주요한 염증성 경로를 주도하는 것을 확인
Methods
Analysis of sc-RNA seq data
- control 5, psoriasis 13 samples
- R (버전 3.6.2)에 설치된 Seurat R 소프트웨어 패키지 (버전 3.0)를 사용, scRNA-seq 데이터 분석을 수행
- 개별 샘플마다 단일 세포 데이터 품질 관리를 이전에 인간 피부 scRNA-seq 분석에서 기술된 방법대로 수행
1. 주성분 분석 및 그래프 기반 군집 분석을 수행
2. 각 군집의 (다른 모든 세포와 비교하여) 유전자 발현 차이를 찾음
* 비슷한 발현 패턴을 갖는 세포를 군집화
3. 군집 내에서 건선 세포와 대조 세포의 평균 유전자 발현을 계산
4. 피부 면역 세포의 각 유형을 나타내는 군집 내에서 건선 세포와 대조 세포를 비교하기 위해 공통된 면역 세포 하위집단의 인접한 군집을 병합했습니다.
* 예를 들어, 다양한 T 세포 하위집단이 있는 경우, 같은 T 세포 유형이지만 다른 특징을 가진 인접한 군집들이 존재할 수 있다.
이러한 유사한 세포 하위집단을 병합하여 비교 분석을 수행하면, 해당 유형의 세포들 간의 차이를 보다 정확하게 평가할 수 있다.
5. 면역 세포 군집 비교를 위해 각 군집 내에서 대상 유전자를 발현하는 세포를 (1) 대상 유전자를 발현하는 세포의 수와 (2) 대상 유전자를 발현하는 세포의 비율로 측정했습니다.
즉, (1) 군집별 DEG 분석 -> 군집 내 case vs control 비교, (2) 공통된 면역 세포 하위집단의 경우 병합, 병합한 군집별 DEG 분석
- iTALK R 소프트웨어 패키지 (버전 0.1.0)를 사용, 수용체-리간드 상호작용 분석
1. 각 군집 내에서 건선 세포와 대조 세포 간의 차이가 있는 유전자를 찾은 후
2. 이들 유전자의 폴드 차이를 사용하여 서로 다른 세포 군집 간의 수용체-리간드 상호작용을 계산
---supplementary data(doc)
프린시펄 컴포넌트 분석과 그래프 기반 클러스터링 분석은 Seurat R 패키지 (버전 3.0)를 사용하여 수행되었습니다. 차원 축소를 위해 20개의 주요 구성 요소 (PCs)가 선택되었으며, 차원 축소를 위한 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction)에 의해 세포들이 클러스터로 묶였습니다. 클러스터링은 FindClusters 함수를 사용하여 0.8의 해상도로 수행되었습니다. 그런 다음, 각 클러스터에 대해 모든 다른 세포와 비교하여 다른 유전자 발현 차이를 찾기 위해 FindAllMarkers 함수를 사용하였습니다. 클러스터 내의 건선 세포와 대조 세포의 평균 유전자 발현은 AverageExpression 함수를 통해 계산되었습니다.
5,000~10,000개의 세포가 microfluidic platform 에 제출되어 droplet-based single-cell library 가 생성될 때, 셀 캡처 중에 형성된 세포 이중체에 의해 발생하는 기술적 아티팩트인 단일 세포 데이터의 2.3%에서 4.6%가 될 수 있습니다 (Chromium Next GEM Single Cell 3ʹ Reagent Kits User Guide, 10X Genomics, 미국). 단일 세포 분석을 위해 가능한 이중체로 추정되는 클러스터를 제거하기 위해, 두 개 이상의 다른 면역 세포 유형의 유전자 signatures 을 발현하는 클러스터는 제외됐다. 또한 유사한 유형의 세포와 공간적으로 분리된 최소한의 세포로 이루어진 클러스터도 제외하였습니다. 총 1,923개의 세포 (7.6%)가 그림 E4의 Doublet.01, Doublet.02, Doublet.03, Doublet.04, Doublet.05, Doublet.06 및 Doublet.07에서 제외되었습니다.
피부 면역 세포 유형을 나타내는 각 클러스터 내에서 건선 세포와 대조 세포를 비교하기 위해, 공통 면역 세포 하위집단의 인접한 클러스터들을 병합하였습니다. Treg.01과 Treg.02는 Tregs로 병합되었습니다. Mature DC.01, Mature DC.02 및 Mature DC.03은 성숙한 DCs로 병합되었습니다. S (Stratum). corneum.01, S. corneum.02, S. corneum.03, S. corneum.04 및 S. corneum.05는 S. corneum으로 병합되었습니다 (그림 E4).
scRNA-seq와 흐름세포술 간의 개별 샘플의 세포 비율을 비교할 때, 면역 세포 하위집단의 클러스터를 더 병합하였습니다. CD161+ T-세포, CD8+ T-세포, CD4+ T-세포 및 Tregs는 T-세포로 병합되었습니다. 성숙한 DCs, 반성숙한 DCs 및 골수 표지세포(macrophages)는 DCs로 병합되었습니다. NK 세포는 다른 백혈구로 분류되었습니다. 메라노사이트(melanocytes)와 각질세포(keratinocytes)는 비백혈구로 병합되었습니다.
면역 세포 클러스터 비교를 위해 각 클러스터 내에서 타겟 유전자를 발현하는 세포들을 (1) 타겟 유전자를 발현하는 세포의 수와 (2) 타겟 유전자를 발현하는 세포의 비율로 측정하였습니다. 비율 = 클러스터 내에서 타겟 유전자를 발현하는 세포의 수 / 클러스터 내 전체 세포의 수 x 100 (%)로 계산되었습니다. 타겟 유전자를 발현하는 세포의 수를 계산하기 위해 모든 타겟 유전자에 대해 1의 휴리스틱 발현 임계값이 적용되었습니다. KYNU는 모든 세포에서 발현 수준이 1을 초과했기 때문에 예외적으로 KYNU에 대해서는 2의 발현 임계값이 적용되었습니다.
----Seurat
FindMarkers 함수는 기본적으로 Wilcoxon Rank Sum test 를 사용하여 주어진 그룹 간에 유의한 차이가 있는 유전자를 식별하기 위해 사용됩니다. 그외 다른 테스트 방법을 사용할 수 있습니다.
- “bimod” : Likelihood-ratio test for single cell feature expression, (McDavid et al., Bioinformatics, 2013)
- “roc” : Standard AUC classifier
- “t” : Student’s t-test
- “poisson” : Likelihood ratio test assuming an underlying negative binomial distribution. Use only for UMI-based datasets
- “negbinom” : Likelihood ratio test assuming an underlying negative binomial distribution. Use only for UMI-based datasets
- “LR” : Uses a logistic regression framework to determine differentially expressed genes. Constructs a logistic regression model predicting group membership based on each feature individually and compares this to a null model with a likelihood ratio test.
- “MAST” : GLM-framework that treates cellular detection rate as a covariate
- “DESeq2” : DE based on a model using the negative binomial distribution
https://satijalab.org/seurat/archive/v3.0/de_vignette.html
-----Wilcoxon Rank Sum test
(개념)
- 모집단(전국의 모든 간염 환자)의 모수(모평균, 모표준편차)를 추정하고 싶을때, 표본집단을 설정하고 표본의 통계량(평균,표준편차)을 추정한다. 이때 데이터는 정규 분포(정규성)을 따라야한다.
- 따라서 비모수 검정이란, 데이터가 정규성을 만족하지 못해 평균,표준편차 등 모수를 사용하지 않는 방법이다.
- 두 그룹간 차이를 검정하는 방법
- 모수 검정 -> t-test, 모수의 평균을 검정
- 비모수 검정 -> 윌콕스 순위-합 검정, 비모수인 중위수(median)를 가지고 검정
- 비모수적 방법으로도 세 그룹 이상이 차이를 비교할 수 있는 검정법 : 크루스칼-왈리스 검정법
(수식적 해석)
- 두 그룹간의 차이의 절대값을 기준으로 숫자가 작은 순으로 순위를 매긴다. +/- 부호간의 순위 합을 계산하여 제일 작은 값을 취한다. 그 값이 임계값(critical value) 값보다
https://free-chicken-forever.tistory.com/107
https://www.youtube.com/watch?v=NZsL2eDQiDQ
---결론
Control 5 sample -> average expression
Case 13 sample -> average expression
두 그룹의 average expression의 차이를 wilcoson sum rank test로 DEG 선별
양측 검정을 사용하며,
• 귀무가설, the null hypothesis (H0): 두 그룹에서 유전자 A의 발현량은 같다.
• 대립가설, the alternative hypothesis (Ha): 두 그룹에서 유전자 A의 발현량은 같지 않다.
Results
Microfluidic partitioning of emigrating cells from human skin empowers single-cell transcriptomic profiling of heterogeneous immune cells under ex vivo conditions
인간 피부로부터 이동하는 세포(cell migration)의 미세유체 분할(?)은 체외 조건에서 다양한 면역 세포의 단일세포 전사체 프로파일링을 가능하게 합니다.
1. 23,220개의 단일 세포 데이터에 대한 차원 축소 분석
- natural killer(NK세포), CD161+ T세포, CD8+ T세포, CD4+ T세포, 조절 T세포, 성숙 DC, 준성숙 DC, 골수세포, 멜라닌세포, 그리고 KC
- (natural killer (NK) cells, CD161+ T cells, CD8+ T cells, CD4+ T cells, Treg cells, mature DCs, semimature DCs, macrophages, melanocytes, and KCs)
- 각각 상피의 다른 층(각각 상피의 각각의 층인 각각 굳은 층, 과립층, 가시층, 기저층)에 클러스터가 식별
2. 백혈구(NK세포, T세포, DC, 골수세포)는 건선 피부에서 53.0%, 대조 피부에서 15.5%를 차지
Cutaneous T17 cells display highly differing transcriptomes depending on IL-17A versus IL-17F expression and IFN-γ versus IL-10 expression
피부 T17 세포는 IL-17A 대 IL-17F 발현 및 IFN-γ 대 IL-10 발현에 따라 매우 다른 전사체를 나타냅니다.
Mature DCs in psoriasis skin express higher levels of IL-23A and IL-36G and lower levels of KYNU than do mature DCs in control skin
건선 피부의 mature DC는 control 피부의 mature DC보다 IL-23A 및 IL-36G의 높은 수준을 발현하고 KYNU의 낮은 수준을 나타냅니다.
matrue DC marker gene :
(1) high expression of MHC class II molecules;
(2) skin DC marker8 expression of CD86, DC-LAMP (LAMP3), CD205 (LY75), CD40, CIITA, CD80, PD1-L1 (CD274), and PD1-L2 (PDCD1LG2);
(3) expression of the DC-regulatory tryptophan metabolism enzyme31 KYNU (Fig 4, A and see Fig E10, C).
matrue DC 에서 건선 피부와 control 피부간의 marker(=DEG) :
(1) 건선에서 IL-23A 및 IL-36G 발현 증가 : matrue DC에서 IL-23A 또는 IL-36G 발현은 대조군 피부(1.5%[4/269])에서 건선 피부(6.2%[148/2390])까지 4.2배 증가했습니다
(2) 건선에서 KYNU 발현 감소 : matrue DC에서 KYNU 발현은 대조군 피부(21.6%[58/269])에서 건선 피부(10.4%[249/2390])까지 2.1배 감소했습니다(Fig E10 , C 및 D 참조 ).
Semimature DCs in psoriasis skin express high levels of IL-10, BDCA-3, and LILRB2, but a subset of semimature DCs also expresses IL-23A and IL-36G
건선 피부의 Semimature DC는 높은 수준의 IL-10, BDCA-3 및 LILRB2를 발현하지만, IL-23A 및 IL-36G 또한 발현합니다.
Semimature DC marker gene :
(1) intermediate expression of MHC class II molecules (HLADRB5)
(2) skin DC marker8 expression of CD11c (ITGAX), SIRPA, CD14, AIF1 and DC-SIGN (CD209)
(3) high IL-10 expression (Fig 4, A and see Fig E10, B).
Semimature DC 에서 건선 피부와 control 피부간의 marker(=DEG) :
(1) 건선에서 DCA-3 (THBD)와 LILRB2 (ILT4) 발현 증가 : 높은 수준으로 동시에 발현하며, 46.5% (129개 중 60개)는 BDCA-3와 동시에 발현
(2) 건선에서 41.9% IL-10 과 LILRB2 동시 발현
(3) 건선에서 BDCA-3, DCR1 (TNFRSF10C), ITGAM, LILRB2, LILRB1 및 LILRB4 발현 증가
(4) 건선에서 BDCA-1 (CD1C) 발현 감소
(5) 건선에서 BDCA-3–to–BDCA-1 비율 증가 : The BDCA-3–to–BDCA-1 ratio increased 5.2 times from the control skin (1.6) to the psoriasis skin (8.4) (Fig 5, E).
(6) matrue DC와 동일하게 IL-23A와 IL-36G를 더 많이 발현하는 반면 IL-10을 발현하는 세포와는 독립적
scRNA-seq of emigrating cells from human skin identifies the locations of KC transcriptome changes implicated in psoriasis pathogenesis
인간 피부로부터 얻은 emigrating cell은 scRNA-seq을 통해 건선 발병과 관련된 KC 전사체 변화의 위치를 식별합니다.
(결과를 비판적으로 생각하며 작성합니다.)
Discussion
- 일반적으로 피부 조직은 주로 각질 세포 (KCs)와 섬유아세포로 구성되어 있으며, 면역 세포는 전체 세포의 5% 미만을 차지합니다.
- 전체 조직을 효소로 소화하여 면역 세포를 분리하는 경우, 세포의 유전자 발현이나 기능에 영향을 줄 수 있습니다.
효소 소화 및 정제에 따른 세포의 변화는 단일세포 전사체 분석 결과에 영향을 미칠 수 있으며, 심지어는 면역 세포의 기능 자체에도 영향을 줄 수 있습니다.
- 인간 피부에서 면역 세포 하위집단의 단일세포 전사체를 얻기 위해 최소한의 조작을 수행했습니다. 즉, 효소 소화 조작 없이 생검 샘플을 48시간 동안 배양합니다.
- 면역 세포의 유전자 발현 상태와 기능을 보다 정확하게 탐구할 수 있는 장점을 가지고 있습니다. 이를 통해 피부 면역 세포의 다양성과 질환에 대한 이해를 높이고, 치료 전략 개발에 도움이 될 수 있습니다.
- 새로운 단일세포 접근법을 통해 다음과 같은 피부 T17세포 하위집단을 발견
(1) IL-17A+IFN-γ+ T17세포, (2) IL-17A+IFN-γ– T17세포, (3) IL-17A+IL-17F+ T17세포, (4) IL-17F+IL-10– T17세포, 그리고 (5) IL-17F+IL-10+ T17세포 (도표 3, B).
- IL-17A+ IFN-γ+ (IL-17A와 IFN-γ를 모두 발현하는 T17 세포) 은 pathognic (병원성) 집단으로써,
TNF, IL-26 및 IL-36G의 수준이 높게 합성되며,
이러한 세포는 대부분 CD8+ T 세포 내에서 발현되며, cytotoxic marker(cytotoxic type 17 T cells)와 함께 발현된다.
- 건선 병변에서 얻어진 T 세포의 대부분은 IL-17F+IL-10- (해당 하위집단은 IL-17을 생산하면서 IL-10을 생산하지 않는 세포)로써,
건선 환자의 병변에서 가장 큰 하위집단을 형성한다.
(1) IL-17F를 생산하는 세포가 IL-17A와 IFN-γ를 동시에 생산하는 세포보다 더 빈번하게 나타남
(2) IL-17F+ 세포는 IL-23 수용체의 발현이 가장 높다. 이는 IL-23 수용체에 대해 가장 강한 영향을 받음을 시사한다.
(3) IL-17F+ 세포는 사이토카인 IL-1B, CSF-2, LTA, IL-24 및 IL-34의 높은 발현을 보인다.
이는 IL-17A와 IFN-γ를 생산하는 세포와는 다른 염증 잠재력을 나타낸다.
(4) FoxP3가 가장 높은 발현을 가지고 있기 때문에 Treg 세포의 염증성 전환에서도 기인할 수 있다.
- 비병원성 세포에서 얻어진 T세포는 IL-17F+IL-10+ 이다.
(1) 전체 T17 세포의 4%만 구성
(2) 낮은 수준의 FoxP3 발현
(3) 높은 수준의 아릴 탄화수소 수용체(AHR) 및 MAF를 발현
AHR은 c-Maf (MAF)와 상호 작용하여 Tr1 세포의 분화를 촉진하는 역할
즉, 비병원성 세포는 병원성 세포보다 Treg 세포가 아닌 Tr1 세포로 분화하는 능력을 갖는다.
- 건선 피부에서 mature DC는 MHC 및 costimulatory molecules의 고발현을 보인다.
(1) the reason for the highly T-cell–stimulatory nature of these cells.
: T 세포들과 상호작용하며 면역응답의 조절과 염증과 관련된 병리과정을 보다 촉진한다.
(2) 건선 피부의 mature DC는 대조군 피부의 성숙한 DC에 비해 높은 수준의 IL-23A 및 IL-36G와 낮은 수준의 KYNU를 발현
(3) 건선 피부의 regulatory semimature DCs의 하위 집합은 IL-23A 및 IL-36G를 발현.
즉, 건선 피부의 조절 DC의 기능 장애는 건선과 관련된 immune tolerance impairment (면역 내성 손상)에 기여할 수 있다.
- 본 논문 접근 방식의 제한사항
(1) 48시간의 체외 배양 및 세포 이동은 세포의 상태를 변경할 수 있습니다. (2) 우리의 연구는 한정된 피부 면역세포 하위집단에 초점을 맞추고 있으며, 다른 면역세포 인구의 존재를 고려하지 않았습니다. (3) 우리는 피부의 단일세포 전사체만을 연구했으므로 조직 내에서의 상호작용이나 인접한 세포의 영향을 고려하지 않았습니다.
scRNA-seq 을 이용하여 인간 건선 피부에서 이동하는 면역세포의 유전자 발현 패턴을 분석했다.
건선을 비롯한 염증성 피부 질환에서 면역세포의 변화를 이해하고, 이에 대한 새로운 통찰력을 제공가능한 구 플렛폼을 제안했다.
또한, 이 연구 방법은 면역 표적 치료에 의해 백혈구의 유전자 발현이 어떻게 조절되는지를 연구하는 데에도 적용될 수 있다.
향후 다른 염증성 피부 질환 연구나 면역 표적 치료에도 활용될 수 있을 것으로 기대